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#教学交流

一、图解限制酶的选择原则

(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。

(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。

(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。

二、利用PCR法获取和扩增目的基因

从某个DNA中获取目的基因（目标序列）这个DNA就相当于模板DNA了，需要进行PCR扩增的是这个DNA上某个特定的基因。因此要设计好引物，然后进行PCR，经过3个循环就能获得目的基因。

三、PCR扩增目的基因时添加限制酶的识别序列

如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列(A )

注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同。

A.NdeⅠ和BamHⅠ B.NdeⅠ和XbaⅠ

C.XbaⅠ和BamHⅠ D.EcoRⅠ和KpnⅠ

目的基因的插入要有正确的方向才能正确表达，载体和目的基因的酶切用的是两种不同的酶，就可以实现目的基因的定向插入。

例：若要利用某目的基因(见图甲)和P₁噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A^↓GATCT)、EcoRⅠ(G^↓AATTC)和Sau3AⅠ(^↓GATC)。下列分析合理的是 ( )

四、高考试题分析

(2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。

(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是__________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是____________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要________种酶。

简要分析一下：

荧光蛋白基因的左侧为终止子，为了能指导荧光蛋白基因表达，扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧，而右侧有三个酶切位点，分别是Mun1、EcoRI和Xhol的切割位点，但因为用EcoRI会破坏荧光蛋白基因，所以只能用MunI和XhoI切割载体，切割后载体的部分序列如图所示：

需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向（RNA聚合酶的移动方向）与荧光蛋白基因的读取方向（RNA聚合酶的移动方向）一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。

观察最右侧给出的限制酶的识别序列和切割位点的特点发现：限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，限制酶XhoⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶SalⅠ识别并切割后的黏性末端相同。

有同学会发现，怎么构建好的一个基因表达载体，怎么出现了2个启动子相反的情况。事实上无论是大肠杆菌表达系统、酵母菌的表达系统、哺乳动物细胞表达系统中相关目的基因的启动子方向与标记基因的启动子方向相反。

如上图中构建好的重组载体中荧光蛋白基因右侧的启动子与图中P（雌激素诱导下发挥作用）启动子方向就相反。

（2021天津，16题）、（2021辽宁，24题）、（2021福建，21题）等都在考查基因工程的相关知识：利用两种酶构建基因表达载体，并根据限制酶的切割位点判断引物应该设计的碱基序列等，是高考热门考点。（具体题目不展示了，自己分析吧）

以上内容是自己的分析，对实际教学也有帮助。喜欢的话，就分享一下吧！